歐洲藥典近二十年來，已先后出了好幾版，在2007年版即提到支原體的NAT法（即核酸擴(kuò)增技術(shù)，如PCR，熒光定量PCR等）可替代藥典傳統(tǒng)方法。

歐洲藥典強(qiáng)調(diào)了對核酸檢測方法的驗證，包括檢測限、特異性和耐用性（robustness）。

在檢測限方面，歐洲藥典指出，核酸擴(kuò)增法如替代藥典規(guī)定的培養(yǎng)法，其檢測限需達(dá)到10CFU/ml，如替代指示細(xì)胞培養(yǎng)法（即DNA染色法），檢測限需達(dá)到100CFU/ml。也可通過核酸拷貝數(shù)確定檢測限，但應(yīng)提前建立CFU與核酸拷貝數(shù)之間的換算關(guān)系。

在特異性方面，歐洲藥典規(guī)定了NAT法應(yīng)能檢測污染細(xì)胞的常見的9種支原體，包括：

萊氏無膽甾原體（A. laidlawii）

發(fā)酵支原體（M.fermentans）

豬鼻支原體（M. hyorhinis）

口腔支原體（M. oral）

精氨酸支原體（M. arginini）

肺炎支原體（M. pneumonia）

雞毒支原體（M. gallisepticum）

滑液支原體（M. synoviae）

螺原體（Spiroplasma citri）

并且，NAT法應(yīng)檢查與細(xì)菌、哺乳動物DNA是否有交叉反應(yīng)。

在耐用性方面，歐洲藥典強(qiáng)調(diào)檢測結(jié)果的穩(wěn)定性，不受微小波動的影響，因此一般需經(jīng)多輪測試。每次測試也需要做復(fù)孔。

那么，進(jìn)行方法驗證還需要什么呢？標(biāo)準(zhǔn)品？對了。標(biāo)準(zhǔn)品好比一把尺子，能確定你所用的支原體PCR或qPCR檢測試劑盒到底是否符合要求。當(dāng)然，標(biāo)準(zhǔn)品自身也需要標(biāo)定，這個也是可以檢測的。德國MB公司即提供有標(biāo)定過的10CFU/管和100CFU/管的支原體菌株，其中10CFU^TM支原體靈敏度套裝囊括了以上提到的9種常見支原體，而且這些支原體都是凍干粉型滅活的，不會給實(shí)驗室?guī)碇гw污染，這一點(diǎn)也令人很放心。

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