一、初識(shí)支原體 支原體直徑不到0.3 μm，無細(xì)胞壁，可穿過常規(guī)0.22 μm濾膜。它們黏附細(xì)胞表面，爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)，分泌代謝物，改變pH，使細(xì)胞狀態(tài)“悄然滑坡"。

二、常見信號(hào)

1.       生長(zhǎng)放慢：倍增時(shí)間延長(zhǎng)30–50 %。

2.       形態(tài)異常：貼壁細(xì)胞拉絲、圓縮；懸浮細(xì)胞成團(tuán)。

3.       代謝偏移：培養(yǎng)液迅速變黃（酸化），但細(xì)胞密度并未升高。

4.       轉(zhuǎn)染/病毒產(chǎn)量驟降：外源基因表達(dá)效率莫名下降。

三、污染路徑

·         液氮罐：凍存管接口處密封不嚴(yán)，支原體隨液氮?dú)馊苣z進(jìn)入。

·         移液器：槍頭根部殘留液膜成為“藏身點(diǎn)"。

·         共用試劑：胰酶、血清反復(fù)開蓋，氣溶膠逐次累積。

·         人體：手套外壁、袖口、手機(jī)屏等均可攜帶。

四、檢測(cè)方案

1.       常規(guī)培養(yǎng)法：支原體肉湯+瓊脂，28 ℃培養(yǎng)7 d，觀察“煎蛋樣"菌落。

2.       熒光染色：Hoechst 33258染色后，高倍鏡下見細(xì)胞周亮點(diǎn)或絲狀熒光。

3.       快速PCR：16S rRNA保守區(qū)引物，30 min出結(jié)果，靈敏度10 CFU。

4.       實(shí)時(shí)阻抗：細(xì)胞指數(shù)曲線異常漂移，可早期預(yù)警。

五、清除策略

·         試劑處理：購(gòu)買經(jīng)0.1 μm濾膜、γ射線照射的低內(nèi)毒素血清；胰酶分裝一次性使用。

·         環(huán)境管理：生物安全柜每月更換HEPA；CO?培養(yǎng)箱托盤添加專用消毒劑，水位每日檢查。

·         設(shè)備清潔：移液器每周整體高溫滅菌；液氮罐每季度空罐、酒精擦拭內(nèi)壁，凍存管接口用封口膜二次密封。

·         應(yīng)急線：輕度污染——Plasmocin™（50 μg/mL）連續(xù)處理兩周；重度污染——直接丟棄，全面消毒后重新啟動(dòng)。

六、預(yù)防清單

1.       一人一盒：個(gè)人專用移液槍、槍頭盒，減少交叉。

2.       小體積分裝：血清、抗生素、胰酶均按單次用量分裝，避免反復(fù)凍融。

3.       手套勤換：每步操作后更換，杜絕“手套環(huán)游"。

4.       定期盲檢：每批次培養(yǎng)基隨機(jī)抽樣，PCR檢測(cè)陰性后再啟用。

5.       記錄追溯：建立電子臺(tái)賬，試劑批號(hào)、使用日期、責(zé)任人一目了然，便于回溯。

七、結(jié)語 支原體雖小，卻能撼動(dòng)整個(gè)實(shí)驗(yàn)。與其事后補(bǔ)救，不如把預(yù)防做成習(xí)慣：規(guī)范操作、定期檢測(cè)、及時(shí)丟棄可疑樣本。讓培養(yǎng)箱成為細(xì)胞安心成長(zhǎng)的“凈土"，數(shù)據(jù)自然更加穩(wěn)健可靠。